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Real-time PCR實驗攻略（基本方法一）

發(fā)布時間： 2022-03-11　　點擊次數(shù)： 5549次

材料與儀器

步驟

實時熒光定量PCR（Real-Time PCR）實驗流程

一、RNA的提取(詳見RNA提取及反轉(zhuǎn)錄)

不同組織樣本的RNA提取適用不同的提取方法，因為Real-Time PCR對RNA樣品的質(zhì)量要求較高，所以，正式實驗前要選擇一款適合自己樣品的提取方法，在實驗過程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。

在總RNA的提取過程中，注意避免mRNA的斷裂；取2ug進行RNA的甲醛變性膠電泳檢測，如果存在DNA污染時，要用DNase I進行消化（因為在處理過程中RNA極易降解，建議體系中加入適量RNA酶抑制劑）

二、DNase I 消化樣品RNA 中的DNA

三、RNA瓊脂糖凝膠電泳

1. 1%的瓊脂糖凝膠電泳凝膠的配制：

1）稱取瓊脂糖0.45 g放入三角瓶中，向其中加入4.5 ml的10×MOPS緩沖液和39.5 ml的DEPC水，放微波爐里溶化。

2）待冷卻到60攝氏度左右時，加入1 ml甲醛，搖勻（避免產(chǎn)生氣泡）。倒入凝膠板上凝固30 min。

2. 取各個RNA樣品4 μl，加入6×RNA電泳上樣緩沖液2 μl混勻，加入變性膠加樣孔中。

3. 120V電壓下電泳25 min。用凝膠紫外分析儀觀察，照相保存。

另外還有一種RNA檢測方法：
濃度檢測：取4 μl RNA，加蒸餾水至1 000 μl，混勻。測OD260、OD280

四、RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA

反轉(zhuǎn)錄程序(以MBI的M-MLV為例)

反轉(zhuǎn)錄引物的選擇與Real-Time PCR引物設(shè)計的要求

1）隨機六聚體引物：
當(dāng)特定mRNA由于含有使反轉(zhuǎn)錄酶終止的序列而難以拷貝其全長序列時，可采用隨機六聚體引物這一不特異的引物來拷貝全長mRNA。用此種方法時，體系中所有RNA分子全部充當(dāng)了cDNA第一鏈模板，PCR引物在擴增過程中賦予所需要的特異性。通常用此引物合成的cDNA中96%來源于rRNA。

2）Oligo(dT)：
是一種僅對mRNA特異的方法。因絕大多數(shù)真核細胞mRNA具有3'端Poly(A+)尾，此引物與其配對，僅mRNA可被轉(zhuǎn)錄。由于Poly(A+)RNA只占總RNA的1-4%，故此種引物合成的cDNA比隨機六聚體作為引物和得到的cDNA在數(shù)量和復(fù)雜性方面均要小。特別適合檢測多個基因的表達，這樣可以節(jié)約反轉(zhuǎn)錄的試劑，cDNA可以多次使用，可用于檢測稀有基因是否表達、從極少量細胞中定量檢測特定mRNA的表達水平。

3）特異性引物：
最特異的反轉(zhuǎn)錄方法是用含目標(biāo)RNA的互補序列的寡核苷酸作為引物，若PCR反應(yīng)用二種特異性引物，第一條鏈的合成可由與mRNA3'端最靠近的配對引物起始。用此類引物僅產(chǎn)生所需要的cDNA，導(dǎo)致更為特異的PCR擴增。
做 Real Time PCR時，用于SYBR Green I/Eva Green 法時的一對引物與一般PCR的引物，在引物設(shè)計上所要求的參數(shù)是不同的。引物設(shè)計的要求：

① Tm=55-65 ℃

② GC=30-80%

③ PCR擴增產(chǎn)物長度：引物的產(chǎn)物大小不要太大，一般在80-300 bp之間都可。

④ 引物的退火溫度要高，一般要在 60 ℃以上。

要特別注意避免引物二聚體和非特異性擴增的存在。而且引物設(shè)計時應(yīng)該考慮到引物要有不受基因組DNA污染影響的能力，即引物應(yīng)該跨外顯子，最好是引物能跨外顯子的接頭區(qū)，這樣可以更有效的不受基因組DNA污染的影響。
至于設(shè)計軟件，PRIMER3，PRIMER5，PRIMER EXPRESS都應(yīng)該可以的。做染料法最關(guān)鍵的就是尋找到合適的引物和做污染的預(yù)防工作。對于引物，你要有從一大堆引物中挑出一兩個能用的引物的思想準(zhǔn)備---尋找合適的引物非常不易。

五、cDNA與引物質(zhì)量檢測
取0.2 ml薄壁PCR管，編號。向各管中加入含染料2×PCR TaqMix10 ul；加入正反向引物各0.5 ul（引物濃度10 uM），向管中加入混合的cDNA各1 ul。各管補加水至20 ul。
組份加量
2×PCRTaqMix 10 ul
10 uMPrimer FW 0.5 ul
10 uMPrimer RV 0.5 ul
Template DNA 1 ul
ddH2O 混勻至20 ul

混勻，置于TP600PCR儀中。95 ℃ 5 min；95 ℃15 s，60 ℃35 s ，40 cycles；72 ℃ 5 min；4 ℃ pause。
取擴增產(chǎn)物各8 μl，DL2000 分子量標(biāo)準(zhǔn)5 μl/泳道。1%瓊脂糖凝膠120V電壓下電泳25 min。用凝膠紫外分析儀觀察。

選擇特異性好，擴增效率高的引物作為實時熒光使用引物。

六、利用相對定量的方法分析目的基因表達量的情況
由于RNA純化后得率不同、RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA的效率不同等客觀因素，用于定量分析的初始樣品濃度不同，因此，在進行基因表達調(diào)控研究中都會用一些看家基因來標(biāo)準(zhǔn)化，以校正因樣品初始濃度不同而造成的差異。常用的看家基因有beta-actin，GAPDH，18SrRNA等。因此，在做基因表達調(diào)控分析時至少要做兩個基因，目的基因和一個看家基因。

七、定量 PCR檢測
取0.2 ml薄壁PCR管，分別編號。向各管中加入2×qPCR TaqMix12.5 ul，10 uM各基因正反向引物混合物0.5 ul，對應(yīng)的cDNA各1 ul。一管中不加模板用作陰性對照。各管補加水至25 ul。

混勻，置于SLAN熒光定量PCR儀中。95℃5min預(yù)變性后，95℃15 s→65℃35 s（熒光檢測），40 cycles。熒光定量PCR一般把退火和擴增設(shè)成一個溫度，只在擴增出現(xiàn)問題時才會考慮設(shè)梯度。

（侯哥論文中的：95 °C 10分鐘→95 °C 15秒→60 °C 1分鐘；40個循環(huán)。）

以雙△Ct值法計算靶基因相對表達水平：

GRP78相對表達水平=2-△(△CT)

注：△CT =Ct(GRP78)-Ct(GAPDH); △(△CT)= △CT (LLLI)- △CT (contro1)。

如果在熒光背景信號階段出現(xiàn)很多拐點，可能的原因是體系未混勻或者存在固態(tài)雜質(zhì)；
如果向下探頭后又很快抬頭然后又向下探頭，可能原因是體系中模板量太高，建議模板稀釋后再用。
如果引物二聚體存在則陰性對照會出現(xiàn)抬頭現(xiàn)象，這在Real-Time PCR中很難避免；
若是陰性對照的溶解曲線出現(xiàn)和樣品中同樣的峰，說明體系配置中存在污染，則實驗結(jié)果不可用。

在溶解曲線中出現(xiàn)雙峰有三種可能：

① 引物峰，引物峰通常是兩峰中的前面一個，消除的辦法是降低體系中的引物量或重新設(shè)計引物；

② 在做基因表達差異時容易出現(xiàn)DNA被擴增峰（只在引物跨內(nèi)含子時存在），出現(xiàn)原因是提取RNA時存在DNA污染，可以通過電泳驗證，這時要重新消化RNA樣品中的DNA；

③ 擴增非特異，這時要重新摸擴增條件或重新設(shè)計并驗證引物。

八、表達差異的計算方法
絕對定量通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算起始模板的拷貝數(shù)；相對定量方法則是比較經(jīng)過處理的樣品和未經(jīng)處理的樣品目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本或是目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本在不同時相的表達差異之間的表達差異。

2-△△CT方法是實時定量PCR實驗中分析基因表達相對變化的一種簡便方法。

在有些情況下，并不需要對轉(zhuǎn)錄本進行絕對定量，只需要給出相對基因表達差異即可。顯然，我們說X基因在經(jīng)過某種處理后表達量增加2.5倍比說該基因的表達從1000 拷貝/細胞增加到2500拷貝/細胞更加直觀。

2-△△CT方法的推導(dǎo)（詳見實時定量PCR和2-△△CT法分析基因相對表達量）

補充：在DNase I 消化樣品RNA 中的DNA后，需要對樣品重新進行氯仿抽提，具體實驗流程如下：

消化后總體積100 ul，體積太少，不利于抽提，我們往往補加200 ulDEPC水。

1. 向離心管中加入等體積氯仿（約300 ul），劇烈顛倒，充分混勻至中層出現(xiàn)白色片狀沉淀。4℃14 000 rpm離心8 min，取上清（約250 ul）。

2. 加入1/10體積的NaAC（3 M）（約25 ul）和預(yù)冷的等體積異丙醇（約280 ul），-20℃放置20 min。

3. 4℃14 000 rpm離心15 min，去上清，注意不要觸到沉淀。

4. 加入1 ml的75%乙醇，4℃14 000 rpm離心3 min，去上清。

5. 瞬時離心，用200 ul（或10 ul）的槍頭小心吸去離心管底的殘存液態(tài)（勿吸到管底的沉淀）。

6. 把離心管放置于超凈臺晾至約5-10 分鐘（勿*干燥，否則很難溶）。加入30~50 μl的無RNase的水，靜止1 min 后，振蕩30sec，瞬時離心。

7. 將提取的RNA立即進行下游實驗，或放-20 ℃保存。

注意事項

北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院阜外心血管病醫(yī)院心外科心血管病國家重點實驗室吳益和分享
實驗中必須堅持的一些好習(xí)慣
1. 加入試劑之前，把它混勻一下，以免放置時間長了濃度不均。
2. 移液槍用完之后要歸到最大計量的位置，防止久而久之彈簧失去彈性。
3. 所有的試劑都自己配，出了問題才好找原因一. 防止RNA酶污染的措施。
一、防止RNA酶污染的措施
1. 所有的玻璃器皿均應(yīng)在使用前于180 ℃的高溫下干烤6 h或更長時間。
2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿沖洗（注意：有機玻璃器具因可被氯仿腐蝕，故不能使用）。
3. 有機玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室溫10 min，然后用0.1% DEPC水沖洗，晾干。
4. 配制的溶液應(yīng)盡可能的用0.1% DEPC，在37 ℃處理12 h以上。然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑，應(yīng)當(dāng)用DEPC處理過的無菌雙蒸水配制，然后經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除菌。
5. 操作人員戴一次性口罩. 帽子. 手套，實驗過程中手套要勤換。
6. 設(shè)置RNA操作專用實驗室，所有器械等應(yīng)為專用。

同實驗其他方法
實時熒光定量PCR技術(shù)
一、樣品RNA的抽提 1. 取凍存已裂解的細胞，室溫放置5分鐘使其*溶解。 2. 兩相分離每1 ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2 ml的氯仿，蓋緊管蓋。手動劇烈振蕩管體15秒后
Real-time PCR實驗攻略（基本方法二）
二、DEPC處理方法如下1. DEPC處理（1）DEPC水：100 ml超純水加入0.2 ml DEPC，充分混勻，高壓滅菌。（2） Tip頭(槍頭）. EP管等在提RNA過程中及做RT時接觸RNA的

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